NỘI DUNG

Định nghĩa, cấu trúc

Phân loại flavonoid

Phân bố flavonoid trong thực vật

Tính chất, định tính, định lượng

Chiết xuất

Tác dụng sinh học, công dụng

Tài liệu tham khảo

DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID

 Actisô, Bạch đồng nữ, Bạch thược,  Bạch hoa xà, Bông,  Cam thảo, Cát căn, Cỏ roi ngựa, Cốt khí củ, Dâm dương hoắc, Đại, Đại bi, Hoa hoè, Hoàng kỳ, Hồng hoa, và các dược liệu cho rutin, diếp cá, núc nác, Hương phụ, Ích mẫu, Khổ sâm, Kim ngân, Kim tiền thảo, Mă đề, Ṃ mâm xôi, Ngải cứu, Ổi, Phan tả diệp, râu mèo,  hồng hoa Sài đất, Táo nhân, Thảo quyết minh, Trần b́, Vối. Xích đồng nam, xạ can, dây mật, tô mộc, Xuyên tâm liên.  

1. Định nghĩa, cấu trúc

Flavonoid là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon. là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong dược liệu nguồn gốc thực vật.

back to top

2. Phân loại flavonoid

Có nhiều cách phân loại khác nhau, cách phân loại thường dùng là dựa vào vị trí của gốc aryl (ṿng B) và các mức độ oxy hoá của mạch 3C.

Euflavonoid	Isoflavonoid	Neoflavonoid
các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2	các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3	các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4
anthocyanidin, flavan*, flavan 3-ol*, flavan 4-ol*, flavan 3,4-diol*, flavanon*, 3-hydroxy flavanon*, flavon*, flavonol*, dihydrochalcon*, chalcon*, auron.	Isoflavan*, Isoflav-3-ene, Isoflavan-4-ol*, Isoflavon*, rotenoid, pterocarpan, Coumestan, 3-phenylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon

Người ta còn phân biệt biflavonoid là những flavonoid dimer, triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan.  

Phần lớn các flavonoid có thể xem là các dẫn chất có gốc phenyl của các nhân trên. Ðánh số thứ tự bắt đầu từ dị vòng, số 1 từ dị tố oxy rồi tiếp đến vòng A, vòng B đánh số phụ. Trường hợp không có vòng C (nghĩa là mạch 3C hở) ví dụ trường hợp chalcon thì đánh số bắt đầu từ vòng B, vòng A đánh số phụ.  

3. Phân bố flavonoid trong thực vật

Flavonoid ít gặp trong thực vật bậc thấp. Trong ngành rêu ít thấy, trong dương xỉ số lượng flavonoid ít nhưng có mặt các nhóm anthocyanin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon.

- Ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ, số lượng flavonoid cũng không nhiều nhưng cũng đủ các nhóm anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon, flavonol, isoflavon. Nét đặc trưng của ngành hạt trần có khác thực vật bậc thấp và ngành hạt kín ở chỗ sự hiện diện của nhiều dẫn chất biflavonoid.

- Flavonoid tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp 2 lá mầm. Có rất nhiều họ chứa flavonoid và đủ các loại flavonoid. Tuy nhiên cũng có một vài nét đặc trưng cho một số họ ví dụ họ Asteraceae là một họ lớn với 15.000 loài, 1000 chi, có rất nhiều dẫn chất thuộc các nhóm khác nhau. Tuy nhiên, một số chi có nét đặc trưng riêng của nó, ví dụ trong các chi Carthamus, Coreopsis, Cosmos, Dahlia thì hay gặp các dẫn chất chalcon và auron. Chi Gymnosperma, Ageratum thì gặp các dẫn chất flavon và flavonol có nhiều nhóm thế có oxy (có thể đến 8 nhóm). Họ Fabaceae thì hay gặp các chất thuộc nhóm isoflavonoid. Họ Rutaceae thường gặp các flavon và flavonol có nhiều nhóm methoxy. Họ Theaceae hay gặp các flavan-3-ol. Họ Ranunculaceae và Paeoniaceae hay gặp các dẫn chất flavonol 3,7 diglycosid. Họ Rosaceae chi Rubrus và Prunus ở trong quả hay gặp các anthocyanin có mạch đường phân nhánh. Họ Polygonaceae ở chi Hydropiper hay gặp các flavon và flavonol sulfat.

- Lớp một lá mầm có 53 họ nhưng cho đến nay chỉ khoảng trên 10 họ tìm thấy có flavonoid: Amaryllidaceae, Araceae, Cannaceae, Commelinaceae, Iridaceae, Lemnaceae, Liliaceae, Musaceae, Orchidaceae, Poaceae.

- Ðộng vật không tổng hợp được flavonoid nhưng trong một vài loài bướm khi phân tích thấy có flavonoid là do chúng lấy từ thức ăn thực vật.

- Hàm lượng và cả thành phần flavonoid trong cây phụ thuộc vào nơi mọc. Cây mọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì hàm lượng cao hơn ở nơi cây thiếu ánh sáng.  

back to top

4. Tính chất, định tính, định lượng

Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không màu (trường hợp các nhóm OH đã methyl hoá), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm đến đỏ cam. Các chất thuô? nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, leuco-anthocyanidin, flavan-3-ol do không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với nhóm carbonyl nên không màu.

Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tuỳ theo pH của môi trường. Tuy nhiên khi các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố khác.

Ðộ tan không giống nhau, thường flavonoid glycosid và flavonoid sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước tốt nhất là cồn nườc. Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước. Các dẫn chất flavonoid có nhóm 7-hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng.

Một số phản ứng định tính (chủ yếu với nhóm euflavonoid)

- Tác dụng của FeCl3: Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng vị trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu.

- Tác dụng của kiềm. Nếu hơ một tổ chức thực vật như cánh hoa, nhát cắt của gỗ hoặc tờ giấy thấm có nhỏ dịch chiết trên miệng lọ ammoniac thì có màu vàng tăng lên tùy theo nồng độ flavonoid và tùy theo nhóm flavonoid. Flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương. Chalcon và auron có thể cho màu đỏ da cam. Một số nhóm khác như flavan-3-ol, flavanon, isoflavon màu không thay đổi. Tuy nhiên nếu thực hiện trong ống nghiệm với dung dịch alkali thì một số dẫn chất flavan-3-ol lại cho màu vì dễ bị oxy hoá, còn flavanon dễ bị isomer hoá thành chalcon nên nếu để một lúc lại cho màu vàng đậm đến đỏ.

- Tác dụng của NaOH đậm đặc và đun nóng (phân hủy kiềm). Ðun flavonoid với dung dịch KOH 30% thì sẽ mở vòng C rồi dẫn đến tạo thành dẫn chất acid thơm và dẫn chất phenol. Tùy theo nhóm thế và vị trí thế vào vòng A và B mà có các dẫn chất acid thơm và phenol khác nhau. Có thể xác định các dẫn chất này bằng phương pháp sắc ký đối chiếu với chất mẫu, kết quả thu được dùng để góp phần biện luận cấu trúc. Ví dụ khi phân huỷ chất Chrysin thì thu được phloroglucin, acid benzoic.  

- Tác dụng của H₂SO₄ đậm đặc:

Acid H₂SO₄ khi nhỏ lên các dẫn chất flavon, flavonol thì cho màu vàng đậm. Ðối với chalcon và auron cho màu đỏ, đỏ thắm, đỏ tươi. Flavanon cho màu đỏ cam rồi đỏ thắm, có thể do chuyển flavanon thành chalcon.

- Tác dụng của antimoin pentachlorid (Phản ứng Martini Bettolo).

SbCl5 trong CCl4 cho màu từ đỏ đến tím với chalcon, vàng đến vàng cam với flavon. Dihydrochalcon thì mất nối đôi liên hiệp giữa nhóm carbonyl và vòng B nên không cho màu với SbCl5 hoặc với H₂SO₄.

- Phản ứng cyanidin (Phản ứng Shinoda hay Willstater). 

Ðây là phản ứng khử hay được sử dụng nhất để tìm sự có mặt của các dẫn chất nhóm flavonoid. Dung dịch flavonoid trong ethanol, thêm bột Mg rồi nhỏ từ từ HCl đậm đặc. Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẩm hoặc đỏ tươi với các dẫn chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanon. Màu sắc đôi khi có thể bị thay đổi tùy theo loại, số lượng, vị trí nhóm thế ví dụ các dẫn chất methoxy flavon (Tangeretin, Nobiletin) thì âm tính. Ðể phân biệt giữa flavonoid glycosid và aglycon của chúng, Bryant đem lắc dung dịch có màu với octanol, nếu màu ở lớp dưới lên hết ở lớp octanol, chất thử là aglycon, nếu lớp octanol không màu, chất thử là glycosid. Cũng cần lưu ý rằng các dẫn chất xanthon ví dụ mangiferin (có trong lá xoài) cũng dương tính với thuốc thử cyanidin.

- Tác dụng của chì acetat trung tính hoặc kiềm.

Phản ứng thực hiện trên giấy thấm. Nhiều dẫn chất flavonoid tạo thành muối hoặc phức có màu khi nhỏ thêm dung dịch chì acetat trung tính hoặc kiềm. Màu phụ thuộc vào các dẫn chất flavonoid.

Nếu tiến hành trong ống nghiệm, chì acetat kièm cho tủa màu với hầu hết các flavonoid phenol còn chì acetat trung tính tạo tủa với những dẫn chất có nhóm o.dihydroxyphenol.

- Phản ứng ghép đôi với muối diazoni.

Các dẫn chất flavonoid có nhóm OH ở vị trí 7 có thể phản ứng với muối diazoni để tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ.

IV. Sắc ký.

Có thể tiến hành S.K.L.M hoặc S.K.G. Dưới đây là bảng ghi một số hệ dung môi và chất hấp phụ hoặc chất mang dùng trong sắc ký một số nhóm flavonoid. Sau khi khai triển, phần lớn các flavonoid được phát hiện trên sắc đồ dựa vào màu sắc của chúng ở ánh sáng thường hoặc huỳnh quang ở ánh sáng tử ngoại (365nm) trước và sau khi tác dụng với kiềm (hơ ammoniac). Có thể sử dụng các thuốc thử của nhóm phenol như bạc nitrat trong môi trường ammoniac, sắt ba chlorid hoặc một số muối kim loại như dung dịch AlCl3, chì acetat trung tính hoặc kiềm.

IV. Quang phổ

Quang phổ tử ngoại giúp ích được nhiều trong việc xác định cấu trúc flavonoid (trong giáo trình này chỉ trình bày sơ lược). Trên phổ người ta chia ra 2 băng hấp thu: băng I nằm trong vùng 290nm trở lên và băng II nằm trong vùng 290nm trở xuống. Trong băng I flavon có đỉnh hấp thu cực đại trong vùng 310-350nm flavonol có 3-OH đã thế trong vùng 330-360nm, flavonol có 3-OH tự do thì 350-385nm. Trong băng II thì cả flavon và flavonol đều có đỉnh hấp thu trong vùng 250-280nm. Isoflavon do gốc phenyl đính ở C-3, không còn hiệu ứng liên hiệp với nhóm carbonyl nên chỉ có băng hấp thu chính ở 250-270nm, còn băng I chỉ có một uốn có cường độ hấp thu ở 300-350nm. Flavanon cũng mất hiệu ứng liên hợp nên băng II là băng hấp thu chính ở vùng 270-290nm. Chalcon hấp thu mạnh ở vùng 300-400nm. Auron ở vùng 380-430nm. Anthocyanin thì hấp thu mạnh trong vùng khả kiến từ 500-550nm (trong MeOH hoặc EtOH + HCl). Người ta còn dựa vào sự chuyển dịch batochrom hoặc hypsochrom của phổ khi thêm các thuốc thử như AlCl3, natriacetat, zirconyl chlorid... vào dung dịch flavonoid để biện luận cấu trúc.

V. Ðịnh lượng.

Phương pháp cân: Chỉ ứng dụng khi nguyên liệu giàu flavonoid và dịch chiết ít tạp chất ví dụ định lượng rutin trong hoa hòe. Các bước định lượng gồm:

a) Loại tạp bằng HCl 0,5%

b) Chiết bằng cồn 96o

c) Thuỷ phân bằng H₂SO_4.

d) Lọc lấy quercetin, sấy cân rồi suy ra hàm lượng rutin.

Phương pháp đo phổ tử ngoại. Dùng phổ từ ngoại, dựa vào độ hấp thu phân tử e hoặc độ hấp thu  ở một l và dung môi qui định cho từng loại flavonoid để định lượng. Có thể kết hợp sắc ký để loại tạp chất hoặc tách thành phần cần định lượng rồi mới đo mật độ quang.

Ðo màu. Bằng phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo phức màu với AlCl3, muối titan, chrom...

 Phổ hấp thu vùng tử ngoại-khả kiến của các loại Flavonoid khác nhau nhưng có cùng kiểu nhóm thế giống nhau.  

back to top

5. Chiết xuất

Không có một phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan trong nước và trong các dung môi hữu cơ. Các flavonoid glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonoid aglycon dễ tan trong dung môi kém phân cực. Các dẫn chất flavon, flavonol có OH tự do ở vị trí 7 tan được trong dung dịch kiềm loãng, dựa vào đó để chiết. Ví dụ để chiết rutin trong hoa hòe ta có thể dùng dung dịch kiềm Na2CO3 loãng để hoà tan flavonoid ra khỏi nguyên liệu, sau đó acid hoá bằng HCl để kết tủa lại rutin.

Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta phải loại các chất thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hoặc ethanol hay hỗn hợp CHCl3 và ethanol. Cồn ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết được phần lớn các flavonoid. Hỗn hợp CHCl3 và cồn hay dùng để chiết các dẫn chất methoxy flavonoid. Các chất anthocyanin thường kém bền vững nhất là các acyl anthocyanin được acyl hoá với các acid aliphatic do đó người ta thường chiết bằng methanol có mặt của các acid yếu như acid acetic, tartric hoặc citric thay vì HCl. Có tác giả dùng một lượng nhỏ acid mạnh dễ bốc hơi là trifluoroacetic acid (0,5-3%) để chiết các polyacylanthocyanin phức tạp vì acid này dể bốc hơi trong quá trình làm đậm đặc. Dịch chiết đem làm đậm đặc dưới chân không ở nhiệt độ thấp (40-70oC). Ðối với những chất dễ bị biến đổi thuộc các nhóm flavan-3-ol, anthocyanin, flavanon, chalcon glycosid thì nên làm đông khô.

Ðôi khi để tinh chế hoặc tách flavonoid, người ta dùng muối chì (xem phần định tính) để kết tủa. Sau khi thu tủa người ta tách chì bằng cách sục dihydrosulfid thì flavonoid được giải phóng.

Ðể phân lập từng chất flavonoid người ta áp dụng phương pháp sắc ký cột. Chất hấp phụ thông dụng là bột polyamid. Có thể dùng các chất khác như bột cellulose, silicagel, magnesol, polyvinylpyrolidon. Silicagel dùng để tách các chất flavanon, isoflavon, methyl và acetyl flavon và flavonol, khai triển bằng CHCl3 và hỗn hợp CHCl3 với ethyl acetat hoặc ether hoặc benzen và hỗn hợp benzen với ethyl acetat hay methanol. Polyamid dùng để tách tất cả các loại flavonoid, khai triển bằng ethanol hoặc methanol với độ cồn giảm dần, hoặc một số hỗn hợp dung môi khác. Muốn có đơn chất tinh khiết thì cần phải sắc ký cột lại vài lần hoặc sắc ký chế hoá. Các flavonoid dimer, trimer có thể tách bằng sephadex LH-20.

Không có một phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan trong nước và trong các dung môi hữu cơ. Các flavonoid glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonoid aglycon dễ tan trong dung môi kém phân cực. Các dẫn chất flavon, flavonol có OH tự do ở vị trí 7 tan được trong dung dịch kiềm loãng, dựa vào đó để chiết. Ví dụ để chiết rutin trong hoa hòe ta có thể dùng dung dịch kiềm Na2CO3 loãng để hoà tan flavonoid ra khỏi nguyên liệu, sau đó acid hoá bằng HCl để kết tủa lại rutin.

Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta phải loại các chất thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hoặc ethanol hay hỗn hợp CHCl3 và ethanol. Cồn ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết được phần lớn các flavonoid. Hỗn hợp CHCl3 và cồn hay dùng để chiết các dẫn chất methoxy flavonoid. Các chất anthocyanin thường kém bền vững nhất là các acyl anthocyanin được acyl hoá với các acid aliphatic do đó người ta thường chiết bằng methanol có mặt của các acid yếu như acid acetic, tartric hoặc citric thay vì HCl. Có tác giả dùng một lượng nhỏ acid mạnh dễ bốc hơi là trifluoroacetic acid (0,5-3%) để chiết các polyacylanthocyanin phức tạp vì acid này dể bốc hơi trong quá trình làm đậm đặc. Dịch chiết đem làm đậm đặc dưới chân không ở nhiệt độ thấp (40-70oC). Ðối với những chất dễ bị biến đổi thuộc các nhóm flavan-3-ol, anthocyanin, flavanon, chalcon glycosid thì nên làm đông khô.

Ðôi khi để tinh chế hoặc tách flavonoid, người ta dùng muối chì (xem phần định tính) để kết tủa. Sau khi thu tủa người ta tách chì bằng cách sục dihydrosulfid thì flavonoid được giải phóng.

Ðể phân lập từng chất flavonoid người ta áp dụng phương pháp sắc ký cột. Chất hấp phụ thông dụng là bột polyamid. Có thể dùng các chất khác như bột cellulose, silicagel, magnesol, polyvinylpyrolidon. Silicagel dùng để tách các chất flavanon, isoflavon, methyl và acetyl flavon và flavonol, khai triển bằng CHCl3 và hỗn hợp CHCl3 với ethyl acetat hoặc ether hoặc benzen và hỗn hợp benzen với ethyl acetat hay methanol. Polyamid dùng để tách tất cả các loại flavonoid, khai triển bằng ethanol hoặc methanol với độ cồn giảm dần, hoặc một số hỗn hợp dung môi khác. Muốn có đơn chất tinh khiết thì cần phải sắc ký cột lại vài lần hoặc sắc ký chế hoá. Các flavonoid dimer, trimer có thể tách bằng sephadex LH-20.