 |
|||||||||||||||
|
THỰC HÀNH 01 THỰC HÀNH 02 THỰC HÀNH 03 THỰC HÀNH 04 1. Ðịnh tính các hợp chất anthranoid trong dược liệu 2. Ðịnh lượng các hợp chất anthranoid bằng phương pháp đo quang THỰC HÀNH 05 THỰC HÀNH 06 THỰC HÀNH 07 THỰC HÀNH 08 THỰC HÀNH 09 THỰC HÀNH 10 THỰC HÀNH 11 THỰC HÀNH 12 
|
ÐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ANTHRANOID
1. Ðịnh tính các hợp chất anthranoid trong dược liệu Nguyên tắc của phản ứng Trong thiên nhiên các hợp chất anthranoid có thể tồn tại dưới dạng oxyhoá (anthraquinon) hoặc dạng khử (anthranol, anthron), dạng tự do (aglycon) hoặc dạng kết hợp (glycosid). Các hợp chất anthranoid khi tác dụng với kiềm (amoniac, natri hydroxyd hoặc kali hydroxyd) sẽ tạo các dẫn chất phenolat có màu đỏ sim tan trong nước, riêng acid chrysophanic không phản ứng với amoniac. Chỉ có các dẫn chất anthraquinon cho màu đỏ, các dẫn chất khử muốn cho màu đỏ phải chuyển thành dạng oxyhoá bằng cách cho tác dụng với các chất oxyhoá như H2O2, FeCl3 (trước khi tiến hành phản ứng), hoặc dung dịch kiềm nóng. Thông thường hay định tính dưới dạng tự do được chiết ra bằng một dung môi hữu cơ (ether hoặc cloroform), khi tác dụng với dung dịch kiềm, toàn bộ các hợp chất anthranoid sẽ chuyển sang dạng phenolat có màu đỏ sim và tan trong lớp nước. Muốn định tính dạng glycosid có thể chiết xuất bằng nước rồi cho tác dụng với dung dịch kiềm ta sẽ có một chất lỏng màu nâu đỏ rất khó phân biệt với những tạp chất khác. Thường người ta thuỷ phân trước khi làm phản ứng và như vậy ta sẽ định tính các hợp chất anthranoid toàn phần (cả dạng tự do và dạng glycosid). Màu của phản ứng này sẽ đậm hơn nhiều so với màu của phản ứng định tính dạng tư. do. Ðịnh tính dang tự do Chiết xuất: Lấy một lượng dược liệu thích hợp cho vào ống nghiệm lớn (10ml). Thêm 5ml nước cất. Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50ml. Làm nguội dịch lọc. Thêm 5ml ether (hoặc cloroform). Lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp ether (hoặc cloroform) để làm phản ứng. Tiến hành phản ứng: - Lấy 1ml dịch chiết ether (hoặc cloroform) cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch amoniac 10%. Lắc nhẹ. Lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp ether (hoặc cloroform) có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu có chứa acid chrysophanic. Thêm tiếp tục từng giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp dung môi hữu cơ sẽ mất màu vàng, còn lớp nước sẽ đỏ thẫm hơn lúc ban đầu. - Lấy 1ml dịch chiết ether (hoặc cloroform) cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp nước sẽ có màu đỏ sim. - Lượng dược liệu thích hợp cho phản ứng: Đại hoàng: 0,5g Cốt khí củ, Thảo quyết minh, Hà thủ ô đỏ: 1g Ðịnh tính anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự do) Cho vào ống nghiệm lớn một lượng dược liệu thích hợp. Thêm 5ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Tiếp tục lọc và chiết như ở trên. - Lấy 1ml dịch chiết ether (hoặc cloroform), thêm 1ml dung dịch amoniac. Lắc nhẹ. Lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp ether có màu vàng thì tiếp tục nhỏ từng giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp ether sẽ mất màu còn lớp nước thì màu sẽ đỏ đậm hơn. - Lấy 1ml dịch chiết ether (hoặc cloroform) cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Ghi chú: Với dược liệu Hà thủ ô đỏ, muốn phản ứng lên rõ hơn có thể tiến hành như sau: Lấy khoảng 0,5g bột dược liệu. Thêm 5ml dung dịch NaOH 2% trong ethanol. Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Pha loãng với đồng lượng nước cất. Lọc nóng dung dịch vào trong bình gạn dung tích 50ml. Acid hóa đến phản ứng acid nhẹ. Thêm 5ml ether. Lắc mạnh. Tiến hành phản ứng định tính với dịch chiết ether như đã nêu ở trên. - Ðịnh tính các hợp chất anthranoid bằng sắc ký lớp mỏng - Dung dịch thử: Lấy 0,1g bột dược liệu (Đại hoàng) cho vào bình nón, thêm 30ml nước cất và 1ml acid hydrocloric đậm đặc (TT) đun cách thủy 15 phút. Để nguội, lọc, lắc dịch lọc với 25ml ether (hoặc cloroform). Gạn lấy lớp ether (hoặc cloroform), lọc qua natri sulfat khan. Bốc hơi dịch ether (hoặc cloroform) đến cắn. Hòa tan cắn bằng 1ml cloroform. - Dung dịch đối chiếu: Hòa tan acid chrysophanic trong cloroform, nếu không có chất chuẩn đối chiếu acid chrysophanic, dùng bột Đại hoàng (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như dung dịch thử. - Bản mỏng Silicagel GF254 đã hoạt hóa ở 1050C trong 1 giờ. - Dung môi khai triển: Ether dầu hỏa - ethyl acetat - acid formic (75 : 25 : 1). - Cách tiến hành: Chấm riêng rẽ lên bản mỏng mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366nm. Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết phát huỳnh quang màu vàng, có cùng giá trị Rf với acid chrysophanic trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Các vết huỳnh quang vàng chuyển thành màu đỏ khi hơ bản mỏng trong hơi amoniac hoặc phun thuốc thử KOH 5%/EtOH. Nếu dùng dược liệu đối chiếu, trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Phản ứng vi hoá: Cắt một lát vi phẫu mỏng, không tẩy rửa, không nhuộm. Ðặt lát cắt vào trong hộp petri có chứa hơi amoniac. Sau một thời gian soi lát cắt dưới kính hiển vi. Các tổ chức có chứa các dẫn chất anthranoid sẽ có màu nâu đỏ. Vi thăng hoa: Trải bột dược liệu thành lớp mỏng trong một nắp chai bằng nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nước. Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5 - 10 phút. Lấy lam kính ra để nguội, soi kính hiển vi thấy tinh thể hình kim màu vàng. Sau khi nhỏ dung dịch natri hydroxyd lên lam kính, dung dịch sẽ có màu đỏ. 2. Ðịnh lượng các hợp chất anthranoid bằng phương pháp đo quang
Nguyên tắc: Dùng acid acetic để thủy phân các dạng anthraglycosid thành dạng aglycon. Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ (ether hoặc cloroform). Tiến hành phản ứng Borntraeger với dịch chiết. Đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 515nm. Các bước tiến hành: · Chiết xuất Cân chính xác a gam bột dược liệu (0,050g nếu là Đại hoàng, 0,100g nếu là các dược liệu khác: Cốt khí củ, Thảo quyết minh, Hà thủ ô đỏ …). Cho dược liệu vào bình cầu hoặc bình nón dung tích 250ml có lắp ống sinh hàn hồi lưu. Thêm 7,5ml acid acetic băng. Đun sôi trong 15 phút trên bếp điện có lưới amiang. Sau khi để nguội thêm vào bình (qua ống sinh hàn ngược) 30ml cloroform. Đun sôi 15 phút trên nồi cách thủy. Làm nguội dịch chiết. Gạn hỗn hợp cloroform - acid qua phễu có giấy lọc vào bình gạn dung tích 100ml (giấy lọc gấp nếp nhỏ đến mức độ tối thiểu có thể). Bột trong bình cùng với giấy vừa lọc lại được đun hồi lưu tiếp tục với 20ml cloroform trong 10 phút. Gạn dịch chiết qua phễu có giấy lọc vào bình gạn trên. Rửa bình và giấy lọc với 10ml cloroform. Gộp các dịch chiết cloroform. · Làm phản ứng màu Cho từ từ vào bình gạn có chứa dịch chiết cloroform 15ml dung dịch NaOH 40%. Lắc nhẹ, (phản ứng tỏa nhiệt, nếu cần, làm lạnh bình gạn dưới vòi nước lạnh). Thêm vào bình gạn 25ml dung dịch NaOH 5% có chứa 2% amoniac. Lắc đều. Gạn lớp nước có màu đỏ vào bình định mức 100ml. Tiếp tục lắc lớp cloroform với dung dịch NaOH 5% có chứa 2% amoniac đến khi lớp nước không còn có màu. Thêm dung dịch NaOH 5% có chứa 2% amoniac vào bình định mức đến đủ 100ml. Rót dung dịch ra một cốc có mỏ dung tích 200ml rồi đặt lên nồi cách thủy sôi trong 20 phút. Để nguội rồi cho lại vào bình định mức. Thêm dung dịch NaOH 5% có chứa 2% amoniac cho đủ 100ml. · Đo mật độ quang Đo mật độ quang ở bước sóng 515nm, cốc đo dày 1cm với mẫu trắng là dung dịch NaOH 5% có 2% NH4OH. · Thành lập đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính - Pha dung dịch mẫu chuẩn Nguyên tắc: Cân chính xác 0,0100g acid chrysophanic hòa tan hoàn toàn trong 10ml cloroform. Dung dịch này được làm phản ứng màu Borntraeger theo phương pháp của Auterhoff. Cho từ từ 15ml NaOH 40%, rồi 25ml dung dịch NaOH 5% có 2% NH4OH vào dung dịch trên, lắc, gạn lớp nước màu đỏ vào một bình định mức có dung tích 100ml, rồi lại lắc tiếp với dung dịch NaOH 5% có 2% NH4OH đến khi không màu. Gạn dung dịch màu vào bình định mức trên, thêm dung dịch NaOH 5% có 2% NH4OH cho đủ 100ml. Dung dịch này là dung dịch mẹ (nồng độ 0,1% = 10.10-3%) dùng pha các mẫu có nồng độ khác nhau để đo mật độ quang học. - Pha dung dịch đo quang Từ dung dịch mẫu chuẩn 10.10-3% pha một thang nồng độ từ 0,5.10-3 đến 2,5.10-3%. Lấy 5ml dung dịch 10.10-3% pha thành 100ml, được dung dịch có nồng độ 0,5.10-3%. Tương tự lấy 10ml, 15ml, 20ml và 25ml dung dịch 10.10-3% pha thành 100ml, được dung dịch có nồng độ tương ứng là 1,0.10-3%; 1,5.10-3%; 2,0.10-3% và 2,5.10-3%. - Đo mật độ quang học của thang dung dịch acid chrysophanic chuẩn ở bước sóng 515nm.
Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang học với nồng độ.
Đường chuẩn định lượng anthranoid trong dược liệu theo acid chrysophanic Từ mối tương quan giữa mật độ quang học với nồng độ là tuyến tính, xây dựng được phương trình hồi quy tuyến tính y = 227,8x + 0,0098 với r2 = 0,999872 hay r2 = 1 trong đó y là mật độ quang học (A) và x là nồng độ. Tính kết quả Hàm lượng phần trăm dẫn chất hydroxyanthracen trong dược liệu tính theo acid chrysophanic, được tính theo công thức:
Ghi chú: Kết quả thu được từ phương pháp trên là phản ánh lượng anthranoid toàn phần, bao gồm dạng tự do, dạng glycosid, dạng oxy hoá và dạng khử. Nếu muốn định lượng riêng từng dạng thì cần chú ý: - Nếu muốn định lượng dạng tự do, bỏ qua quá trình thuỷ phân với acid acetic - Nếu muốn dịnh lượng dạng oxy hoá thì bỏ qua quá trình đun nóng 20 phút trước khi so màu. - Kết quả dạng khử được tính từ mật độ quang của hiệu số 2 lần đo trước và sau khi đun nóng. - Nồng độ dạng glycosid là hiệu số giữa nồng độ phần trăm dạng anthranoid toàn phần và dạng tự do. ------------------------------------------------------- Mọi thông tin liên quan đến trang web Xin vui lòng liên hệ theo số điện thoại 01234195602 hoặc theo địa chỉ Email: thannv@hup.edu.vn Revised: February 18, 2017 . |
||||||||||||||
